自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的杀伤功能
撰稿 金伯泉
(一) 原理
NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中，能杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞，无需抗原或有丝分裂原刺激，亦不依赖抗体或补体，在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。
LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下，获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能，在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。
通过将同位素５１Cr掺入到NK的靶细胞K562（红白细胞白血病细胞）或LAK的靶细胞LiBr(黑色素瘤细胞)，按一定细胞比例与效应细胞(NK或LAK)孵育4小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的５１Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。
(二) 方法
1. 效应细胞的制备
NK功能效应细胞可取静止的的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。
LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或体液(癌性胸腹水)中纯化的淋巴细胞(1×10６／ml)在含有高剂量IL-2(200～1000μ／ml)的10％FCS
RPMI1640 诱导2～5天而成。
2. 杀伤试验
主要有4h５１Cr释放法和３H-TdR释放法，前者要求５１Cr质量好，犕,位素半衰期较短，操作所需时间短；后者需要无菌操作，所需时间较长。
(1) ５１Cr4小时释放试验
收获处于对数生长期的靶细胞(K562，LiBr等)
洗涤后调整细胞浓度为2×10６／ml
↓
取1×10６细胞(0.5ml)，加Na２ ５１CrO４ 100μci
37℃孵育2～3h，每15min轻轻振摇一次
↓
用10％FCS RPMI1640洗涤3次，每次800rpm，5min
↓
重悬细胞浓度1×10５／ml
↓
96孔V型或U型培养板中，每孔加100μl(1×10４细胞)
每份3个复孔
↓
每孔加入100μl不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100μl
1％TritonX-100；自然释放组加100μl完全培养基
↓
200g 离心1min
↓
37℃、CO２孵箱 4h
↓
200g 离心 1min
↓
每孔取出100μl上清，γ计数仪上测定cpm值
计算
实验组cpm-自然释放cpm
特异性杀伤率(％)＝─────────────
最大释放cpm-自然释放cpm
(2) ３H-TdR释放试验
收获处于对数生长期的靶细胞(K562、LiBr等)洗涤后
调整细胞浓度为2×10６／ml，加３H-TdR 20μci
↓
37℃孵育2～3h
↓
用10％FCS RPMI1640洗涤3次，每次800rpm, 5min
调整细胞浓度为1×10５／ml
↓
96孔U型或平底培养板中，每孔加100μl(1×10４细胞)
每份3个复孔
↓
每孔加入100μl不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加
100μl 1％ TritonX-100，自然释放组加100μl完全培
养基
↓
CO２孵箱培养18～24h
↓
每孔吸出100μl上清，加入胰蛋白酶(终浓度0.15％)
和DNA酶(终浓度为0.0125％)
↓
继续孵育30min
↓
用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上
↓
干燥后，移入液闪瓶中，加入1ml闪烁液，β液
闪仪中测cpm值
计算
实验组cpm
特异性释放率(％)＝( 1- ────── )×100％
对照组cpm
(三) 试剂和器材
1. 细胞系： K562， LiBr
2. 10％FCS RPMI1640
3. rHu IL-2
4. ３H-TdR, ５１Cr
5. 培养瓶、培养板，CO２孵箱
6. β-液闪仪，γ-计数仪
(四) 注意事项:
1. 每次试验最好取3～4个不同效应细胞／靶细胞比例，常用效靶比例为100∶1、50∶1，25∶1，12.5∶1。
2. 诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。
3. 避免同位素污染。
根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，牫#用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞(见表)。
用Percoll不连续密度梯度离心法纯化人NK细胞
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梯 度 顺 序
加样细胞 ────────────────────────
1 2 3
4 5
───────────────────────────────────────
Percoll浓度(％) ── 40.0 42.5 45.0 47.5 50.0
细胞回收率(％) 100 1.6 3.5 8.5 28.5 21.5
LGL (％) 12 5 82 74 7 2
lu／10７ 细胞 42 16 192 143 4 1
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１个溶解单位(Lytic unit, LU)为一定效应细胞30％溶解(杀伤)5×10３靶细胞(K562)的水平。
如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞(T细胞)，因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体(ER)。具体方法是将Percoll分离的位于第2、牫梯度的细胞洗涤后调整细胞浓度为5×10６／ml，移入试管，加入2mlFCS和2ml1×10８／mlSRBC，100g离心5min,29℃孵育1h，轻轻重悬细胞，叠加于3ml
Ficoll上，400g室温下离心30min界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可>90％。
在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用NH４Cl方法，因为后者可降低NK功能。
在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄，不同小鼠系NK活性有明显的差别(表)
不同小鼠品系NK活性差别
NK高水平系 CBA／J C3H／J C57BL／6 C57BL／10 DBA2
NK低水平系 A／Sn A／J AKR SJL BALB／c
3周以内或超过3个月以上小鼠的NK水平一般很低。